Диагностика

• • Оценка гуморального иммунитета
• • Оценка клеточного иммунитета
• • Количественная оценка клеточного иммунитета
• • Проточная цитометрия
• • Качественная или функциональная оценка клеточного иммунитета
• • Оценка системы комплемента
• • Оценка фагоцитоза
• • Генетическая оценка врожденных нарушений иммунной системы
• • Схема обследования иммунодефицитных состояний

Чтобы задуматься о нарушениях функции иммунной системы в ежедневной клинической практике, Европейская Ассоциация иммунодефицитов (ESID) уже в 2012 году разработала „тревожные симптомы” у взрослых и детей.

В работе клинициста самое тяжелое отличить первичные иммунодефициты от вторичных, что часто определяет подход к дальнейшей терапии и возможности назначить государством оплаченные медикаменты. Если клинически у нас есть подозрения на иммунодефицит (в этой части мы в основном будем говорить о первичных иммунодефицитах, которые можно диагносцировать в любом возрасте), тогда начальное лабораторное обследование начинается с базисных тестов: полный анализ крови с лейкоцитарной формулой, определение уровня иммуноглобулинов, белковый электрофорез и тест на ВИЧ. Лабораторное обследование детей с повторными инфекиями зависит от истории болезни и дополнительного обследования. При оценке рентгенограммы грудной клетки маленького ребенка нужно обратить внимание, видна ли тень тимуса, что может быть важной находкой в случае серьезного отсутствия Т лимфоцитов. У старших детей и взрослых могут быть рубцы от предыдущих инфекций, признаки интерстициальной болезни легких или бронхэктазы. У всех детей с пневмонитом или полипами носовых пазух носа нужно делать потовый тест для определения цистического фиброза.

Обследуя пациента с подозрениями на первичный иммунодефицит, нужно обратить внимание на те компоненты иммунной системы, которые больше вовлечены, основываясь на начальную оценку пациента.

Оценка гуморального иммунитета

Антитела это гликопротеины, которые составляют большую часть от протеинов плазмы. Антитела продуцируются Б клетками, которые дифференцируются как плазматические. Во время иммунного ответа первыми вырабатываются антитела класса IgM. В секретах слизистой в основном продуцируются антитела класса IgA, а в плазме – IgG. IgG делится на 4 субкласса: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В основном на полисахаридные антигены образуются IgG2 подкласс, а на протеины - IgG1 и IgG3. Длительная повторная стимуляция антигеном индуцирует синтез IgG4 подкласса.

Антителам принадлежит существенная роль в защите дыхательных путей, слизистой кишечного тракта и мочевых путей. Поэтому у людей, с соответствующей патологией, часто развиваются повторные воспаления среднего уха, бронхиты и пневмонии. Повторные воспаления легких могут способствовать развитию бронхоэктазов. Самые частые патогены инфекций легких это бактерии с полисахаридными капсулами, например, Streptococcus pneumoniae un Haemophilus influenzae. Хронический понос могут вызвать Giardia lamblia, Salmonella enterica, Campylobacter jejuni инфекции ротавирусами. В связи с дефицитом антител могут развиться также инвазивные инфекции как сепсис, менингит, остеомиелит и подострый инфекционный артрит, которые могут вызвать также Staphylococcus aureus, Pseudomona aeruginosa un Mycoplasma.

Количественная оценка гуморального иммунитета

Уровни иммуноглобулинов (IgG, IgM, IgA и IgE) нужно сравнить с нормами соответствующего возраста, так как они меняются в зависимости от возраста – после рождения, в детстве и во взрослом возрасте. Если исключены вторичные причины гипогаммоглобулинэмии (смотреть таблицу N 1), низкий уровень любого иммуноглобулина может свидетельствовать о гуморальном или комбинированном иммунодефиците.

Таблица N 1. Вторичные причины дефицита антител

IgG меньше чем 300 mg/dL, общий Ig (IgG + IgM + IgA) меньше чем 500 mg/dL или полное IgA и/или IgM отсутствие у ребенка, который старше 6 месяцев, свидетельствует о гуморальном иммунодефиците. Селективный IgA дефицит самый частый врожденный гуморальный иммунодефицит, часто без симптомов, но у части пациентов наблюдаются повторные инфекции слизистой и/или аутоиммунные проблемы. Субклассы IgG не измеряют как скрининг, но рассматривают для оценки гуморального иммунитета, если уровень IgG на нижней границе нормы и/или слабая реакция на вакцинацию или ее вообще нет. Субклассы иммуноглобулинов измеряют детям старше 1 года.

Несмотря на нормальный уровень IgG, при образовании функциональных антител могут образовываться дефекты. Поэтому нормальный уровень иммуноглобулинов полностью не исключает гуморальный иммунодефицит. И следовательно, нужно оценить способность образовывать функциональные антитела. Это возможно, измеряя титр антител (обычно изотипы IgG) против специфических антигенов. Эти антитела вырабатываются как реакция на иммунизацию или инфекцию (известные как специфические антитела).

Повышенный уровень IgE (>100 U/ml) может свидетельствовать об аллергии, экземе, часто хронических инфекциях или паразитарных инфекциях. Очень повышенный уровень IgE ( >2000 U/ml) у пациентов с обострением экземы не является чем то необычным, однако заставляет задуматься о моногенных нарушениях при атопии или о гипер IgE синдроме (иммунодефиците). IgD не определяют как часть оценки при скрининге. У этого иммуноглобулина есть значение в диагностике периодических лихорадок.

Качественная оценка гуморального иммунитета

Функцию антител оценивают, проверяя реакцию пациента на два типа антигенов: белковые антигены и полисахаридные антигены.

- чтобы оценить ответную реакцию на белковые антигены, используется определение антител к столбняку, дифтерии, а также к коньюгированной пневмококовой вакцине (например, Previnar). Также можно использовать определение титра антител к другим вакцинам (например, A un B гепатиты, кори и другим).

- чтобы оценить реакцию к полисахаридным антигенам, используется определние антител к различным серотипам пневмокока в полисахаридных вакцинах (например, Pneumovax 23, Pnu-imune 23) или (если пациент получает терапию иммуноглобулинами) после вакцин Salmonella Typhi M, Typhim Vi, Haemophilus influenzae B. Эти тесты можно использовать у взрослых и детей, которые старше двух лет. Эта реакция особенно важна, диагносцируя селективный дефицит антител. В Латвии определение специфических антител к полисахаридным антигенам недоступна.

Оценка клеточного иммунитета

В основе клеточного иммунитета находятся T клетки. Дефекты, которые влияют на эти клетки, манифестируются как более тяжелые иммунодефициты. Так как Б клеткам для синтеза антител необходима также нормальная функция Т клеток, большая часть Т клеточных дефектов приводит к развитию комбинированного (клеточного и гуморального) иммунодефицита.

Поэтому оценка количества Т клеток и их функция является важной у пациентов с "только" дефицитом антител, особенно у тех, у кого есть аутоиммунность или определенные инфекции - тяжелые вирусные и/или бактериальные или оппортунистические инфекции. Нарушения, которые могут ухудшить клеточный иммунитет, отличаются в различных возрастных группах.

У детей, которые младше одного года, первичные иммунодефициты являются самой частой причиной ухудшения клеточного иммунитета. Хотя перинатальная цитомегаловирусная или другая герпесная инфекция может также вызвать преходящий или постоянный клеточный иммунодефицит. Экспозиция иммуносупрессивных медикаментов in utero (например, fingolimoda, azatioprina) может вызвать преходящий клеточный иммунодефицит.

У старших детей и взрослых главными причинами подавления клеточного иммунитета являются вирус иммунодефицита человека (VIC) и ослабление иммунитета из за лечения аутоиммунных болезней, злокачественных заболеваний или после трансплантации. Иногда легкие формы первичных иммунодефицитов, например неполный ДиДжоржа синдром, могут быть диагностированы только в подростковом возрасте или уже у взрослых. Самые тяжелые формы комбинированного иммунодефицита чаще проявляются клинически у новорожденных, однако с менее выраженными нарушениями могут манифестироваться в подростковом и взрослом возрасте.

Количественная оценка клеточного иммунитета

Лимфопения является ранним показателем тяжелого комбинированного иммунодефицита (ТКИД) у новорожденных и показатель комбинированного иммунодефицита у взрослых детей, иногда и у взрослых. Если у пациента диагностируют лимфопению, обычно проводят цитофлуометрию для определения субгрупп лимфоцитов. В большинстве случаев анализ повторяют, так как вирусные инфекции и другие факторы могут влиять на число лимфоцитов.

Проточная цитометрия

Проточная цитометрия позволяет количественно и качественно подсчитать подгруппы лимфоцитов, включая CD4 и CD8 позитивные Т клетки, Б клетки и натуральные киллеры (НК клетки). В проточной цитометрии используют характерные маркеры для Т клеток (CD3), Б клеток (CD19) или НК клеток (CD56 и/или CD16), и это первый шаг, чтобы оценить детей с подозрениями на ТКИД, а также исключить полный ДиДжоржа синдром, когда существенно снижено количество Т лимфоцитов. Важно определить процентуальное количество наивных Т лимфоцитов и Т клеток памяти у новорожденных, у кого есть подозрения на ТКИД. У здоровых новорожденных почти все Т клетки наивные. Но в некоторых ситуациях (например, попадание Т клеток матери в кровоток ребенка или гипоморфические мутации в вызывающих ТКИД генах) количество Т клеток затронутого ребенка может быть в норме, но почти все клетки будут Т клетки памяти, а не наивные. CD45RA и CD45RO являются антигенами, которые определяют наивные Т клетки и Т клетки памяти.

С помощью проточной цитометрии возможно оценить также состояние Б клеток, исследуя экспрессию маркеров отдельных Б клеток в образце крови (CD19, CD27, IgD, IgM, CD21, CD38). Так можно выделить переходные, наивные и Б клетки памяти (переключенные и непереключенные) и клетки, продуцирующие антитела. Пациенты с общим вариабельным иммунодефицитом (CVID) классифицируются в соответствии с фенотипами B-клеток, определенными с помощью проточной цитометрии. Эта классификация включает анализ состояния созревания B-клеток, который может помочь спрогнозировать неинфекционные осложнения CVID, такие как спленомегалия, лимфаденопатия, аутоиммунитет или гранулематозную болезнь.

В настоящее время в Латвии анализ с помощью проточной цитометрии доступен в нескольких больницах: BKUS, PSKUS и RAKUS, а также в Gulbja лаборатории.

В настоящее время в Европе доступен разработанный EuroFlow стандартный набор тестов проточной цитометрии. Его применение в соответствии с алгоритмом диагностики первичных иммунодефицитов (PID), обеспечивает эффективное и экономичное решение для диагностического скрининга с использованием проточной цитометрии, а также обеспечивает практическое использование классификации PID лимфоидной системы на основе быстрой, чувствительной, простой и воспроизводимой идентификации. Доступны базы данных нормальных референтных уровней, которые обеспечивают основу для стандартизированной интерпретации результатов, полученных индивидуально. Однако следует отметить, что стандартизованная проточная цитометрия, хотя и очень важна для оценки PID, не заменяет и в большинстве случаев должна сочетаться с иммунологическим, функциональным и генетическим тестированием для постановки окончательного диагноза. Следует отметить, что несколько подгрупп пациентов с PID могут иметь минимально измененные или неизменные уровни лимфоидных клеток, например, в некоторых случаях синдрома Ди Джорджа, аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома (АЛПС), синдрома Неймегена и атаксии-телеангиэктазии. В таких случаях более информативны методы функционального и генетического тестирования.

Скрининг новорожденных – будущее Латвии

● TREC (angl. T cell receptor excision circles) анализ – оценка функции тимуса с помощью полимеразной цепной реакции в периферической крови, считая количество клеток - недавних мигрантов тимуса. Главным образом этот тест используют как скрининговый тест у новорожденных с низким количеством лимфоцитов, чтобы сразу после рождения исключить первичный иммунодефицит - тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД).

● KREC (angl. kappa-deleting recombination excision circles) анализ - оценка Б клеток, также используя полимеразную цепную реакцию в реальном времени. В мире используют KREC и TREC для скрининга новорожденных на врожденный иммунодефицит. В Латвии пока эти анализы не делают, но планируют в ближайшем будущем.

Качественная или функциональная оценка клеточного иммунитета

● Тестирование гиперчувствительности кожи замедленного типа является чувствительным индикатором здорового клеточного иммунитета, поскольку для нормального ответа на антиген необходимо, чтобы несколько типов клеток взаимодействовали между собой. Кожные реакции гиперчувствительности замедленного типа можно оценить путем внутрикожной инъекции антигена Candida (Candin) или Trichophyto на наружной поверхности предплечья, что оценивают аналогично реакции Манту. Этот тест можно использовать как простое и экономичное средство для исключения клеточного иммунодефицита у взрослых и детей старшего возраста. Однако к негативным результатам следует относиться с осторожностью, так как могут быть несколько причин.

Функцию Т-клеток in vitro могут определить с помощью теста пролиферации Т-клеток периферической крови в ответ на митогены или антигены.

● Митогены (например, растительные лектины, фитогемагглютинин, конканавалин А)

● Специфические антигены (например, анатоксины столбняка и дифтерии или антигены Candida albicans).
Ответ на митогены можно оценить у пациентов любого возраста, независимо от состояния иммунизации. Специфические тесты на антиген следует использовать только у пациентов, которые ранее были иммунизированы против этого антигена, но они могут быть более чувствительными к дефектам функции Т-клеток, чем тесты на митогены.

Наиболее специфические тесты, оценивающие дефицит Т-клеток, могут включать определение цитокинов (интерлейкинов ИЛ-1, TNF-альфа, ИЛ-6 и ИЛ-18), анализы высвобождения цитокинов, аутоиммунные антицитокиновые антитела, анализы радиочувствительности и цитотоксические тесты с использованием соответствующих клеток-мишеней с антигеном HLA лейкоцитов человека. К сожалению, отсутствие тестов для оценки функционального состояния клеточного иммунитета в Латвии снижает распознавание иммунодефицитов.

Оценка системы комплемента

Нарушения комплемента могут быть врожденными или приобретенными. Моногенные дефициты комплемента могут быть причиной восприимчивости к инфекциям, предрасположенности к аутоиммунным заболеваниям или их комбинации. Скрининг определения классического пути активации комплемента показан пациентам с любым из следующих патологий:

● Рецидивирующие необъяснимые гнойные инфекции с нормальным уровнем лейкоцитов и иммуноглобулинов, а также нормальными специфическими антителами;
● Рецидивирующие инфекции Neisseria в любом возрасте;
● Несколько членов семьи, перенесших инфекцию Neisseria;
● Пациенты с сепсисом в анамнезе, вызванным инфекцией Neisseria.

Система комплемента также должна быть оценена у любого пациента с системной красной волчанкой (СКВ) или семейной предрасположенности к СКВ.

Первоначальный скрининговый тест на дефект комплемента - это определение общей гемолитической способности комплемента (CH50), который оценивает функцию классического пути активации. Если CH50 значительно снижен или равен нулю, измеряются уровни отдельных компонентов комплемента. Низкие уровни некоторых компонентов, особенно низких C3 и C4, указывают на потребление комплемента, а не на первичный дефицит комплемента. Если CH50 в норме и все еще подозревается дефект комплемента, можно выполнить APH50, скрининговый тест альтернативного пути. Недостатки компонентов комплемента альтернативного пути включают дефицит пропердина и фактора D, которые встречаются редко. Каждый конкретный фактор комплемента и ингибитор комплемента могут быть оценены специализированными лабораториями на предмет его уровня и функции.

В Латвии в лаборатории клинической университетской больницы им. П. Страдыня (PSKUS) доступен тест для оценки всех трех путей активации компонентов комплемента методом ELISA, определяющий образование терминального комплекса комплемента или неоэпитопа C5b-9, который является альтернативным методом CH50 и APH50. Оценивая все три пути, можно лучше определить возможный дефицит отдельных компонентов (см. таблицу 2).

Таблица 2. Оценка путей активации компонентов комплемента

Также можно определить некоторые отдельные компоненты комплемента, такие как C3 и C4. У пациентов с подозрением на наследственный ангионевротический отек было начато определение ингибитора C1 (INH) и активности C1 INH в больнице им.П.Страдыня. Определение уровней других отдельных компонентов системы комплемента в Латвии не проводится.

Оценка фагоцитоза

Дефекты нейтрофилов приводят к множеству заболеваний, от легких рецидивирующих кожных инфекций до системных инфекций со смертельным исходом. Пациенты подвержены высокому риску бактериальных (таких как Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Nocardia asteroides, Salmonella typhi) и грибковых (таких как Candida и Aspergillus) инфекций, но имеют нормальный иммунный ответ на вирусные инфекции. Наиболее распространенные инфекции поражают дыхательные пути и кожу. Также могут образовываться абсцессы тканей и органов. Другие частые проявления включают патологическое заживление ран, дерматит/экзему, стоматит и задержанную отслойку пуповины. Большинство этих заболеваний диагностируется в младенчестве из-за тяжести инфекции или необычного возбудителя инфекции.

Первый тест для оценки нарушения фагоцитов это общий анализ крови с лейкоцитарной формулой:

● Лейкоцитоз может указывать на возможность нарушения адгезии лейкоцитов (хемотаксиса или экстравазации).
Проточная цитометрия - это следующий шаг в оценке пациента на предмет наличия специфических молекул адгезии.
● Тяжелую нейтропению наблюдают у пациентов с врожденным агранулоцитозом или циклической нейтропенией.
● Панцитопения может проявляться с синдромами недостаточности костного мозга, например апластическая анемия и dyskeratosis congenita.
● Если количество нейтрофилов в норме, но у пациента анамнез свидетельствует о нарушении нейтрофилов, целесообразно оценить функцию нейтрофилов. При хронической гранулематозной болезни (HGS) из-за дефектов нейтрофильной NADPH оксидазы, нейтрофилы не могут синтезировать супероксид, производство которого является основным механизмом внутриклеточного разрушения бактерий. Производство супероксида косвенно проверяется на невозможность восстановления дигидрородамина (DHR) до флуоресцентной формы (что может быть определено с помощью проточной цитометрии). Тест DHR в настоящее время недоступен в Латвии, хотя не так давно его можно было выполнить в BKUS. В настоящее время образцы крови для тестирования DHR отправляются в Германию.

Генетическая оценка врожденных нарушений иммунной системы

Первичный иммунодефицит не всегда выявляется иммунологическими анализами. В этом случае помогает генетический анализ.
В настоящее время патогенные варианты описаны более чем в 430 генах как моногенные причины первичных иммунодефицитов (ПИД). С развитием современных технологий стоимость генетического тестирования резко упала и стала более доступной. Следовательно, генетическое тестирование будет рекомендовано любому пациенту с клиническим подозрением на ПИД, если оно не доказывается иммунологическими анализами.

Сегодня все больше и больше клинических лабораторий предлагают технологии секвенирования следующего поколения (NGS) в качестве метода скрининга первой линии, который позволяет анализировать большое количество генов одновременно, в отличие от традиционного секвенирования по Сангеру, в котором кодирующая часть каждого гена (эксон) анализируется отдельно. NGS в себя включает такие молекулярно-генетические методы исследования как секвенирование панелей генов или целевых генов (angl. targeted gene sequencing, TGS), секвенирование полного эксона (angl. whole exome sequencing, WES) и секвенирование полного генома (angl. whole genome sequencing, WGS). Обычно генетическое тестирование пациента начинается с анализа TGS, который включает анализ определенного количества генов, связанных с ПИД, называемых панелями генов. Этот тест является целенаправленным, доступным по цене, и время выполнения тестирования относительно невелико, если лаборатория регулярно его проводит. Учитывая, что TGS включает только анализ конкретных и хорошо известных в настоящее время генов, это исследование не всегда информативно. Поэтому в качестве следующего шага стоит рассмотреть назначение WES, при котором анализируется большинство кодирующих частей генома, включая переходы кодирующей и некодирующей частей (эксоны и переходы эксон/интрон). Этот анализ дороже, занимает больше времени, но может быть более информативным. Как последний вариант, который редко используется в рутинной диагностике, можно назначить WGS. Это пока дорого, требует много времени и нередко трудно интерпретируем, поскольку объем знаний о роли генетических вариаций в развитии заболеваний за пределами кодирующих частей гена или эксонов в настоящее время ограничен.

Каждый из вышеперечисленных методов имеет свои преимущества и недостатки, которые необходимо учитывать при назначении того или иного теста и интерпретации результатов, поэтому перед назначением стоит проконсультироваться с клиническими генетиками, которые порекомендуют лучшее решение для конкретной ситуации.

В Латвии только с 2018 года генетическое тестирование в некоторых случаях стало доступным в детской клинической университетской больнице (BKUS).

Схема обследования иммунодефицитных состояний

tulkojusi no latviešu valodas Evelīna Možeitoviča, Rīgas Stradiņa universitātes Medicīnas fakultātes studente